Dnase I(Rnase free)試劑是將單鏈或雙鏈 DNA 同等程度的隨機(jī)分解，生成具有 5′-P 末端寡核苷酸的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶。

由于RNase-free DNase I中Protease已幾乎被去除，從而提高了該酶在 pH 中性區(qū)域的穩(wěn)定性。

此外Rnase Free DNase I中添加了Rnase Inhibitor，用于抑制RNA樣品中殘留的RNase核酸酶，

因此可以有效抑制RNA提取過程中Rnase酶對RNA的降解。Stop Buffer終止反應(yīng)后，可通過一步加熱失活DNase I活性。

單位定義

在50 μl體系下，37℃ 10min條件下消化1 μg pBR322質(zhì)粒DNA所需的酶量定義為1個活性單位。

組分

名稱數(shù)量

*Rnase Free DNase I (2 U/μl)500μl

10×RD Buffer1 ml

10× RD Stop Buffer1 ml

*Rnase Free DNase I (2 U/μl)中含有20U/μl的Rnase Inhibitor，故進(jìn)行消化試驗時不需要再額外添加Rnase Inhibitor。

純度

2U的本酶和1μg的16S, 23S rRNA在37℃、pH7.5的條件下反應(yīng)1小時，RNA的電泳譜帶不發(fā)生變化

儲存

置于-20°C，可保存2年。

使用注意事項

1）通常加熱方法即可失活DNase I。如需要去除殘留的變性蛋白，可在37°C消化完畢后使用酚氯仿抽提并沉淀RNA樣品（不進(jìn)行加熱操作）。

2）10× RD Stop Buffer中含有螯合劑用于去除二價陽離子，進(jìn)行加熱失活前，必須加入2 μl 10× RD Stop Buffer并混合均勻，再進(jìn)行熱失活，否則會導(dǎo)致RNA降解。

3）處理完畢的RNA樣品進(jìn)行一步反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時，添加量需要<20%（如20μl的反轉(zhuǎn)錄體系中加入量要<4μl）

Dnase I(Rnase free)試劑恒溫擴(kuò)增使用策略及實例展示

應(yīng)用實例1：在以A3824-03或 A3828-03，用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測試。Bst4.0 SYBR Green試劑可在標(biāo)準(zhǔn)定量PCR儀或恒溫?zé)晒鈨x上進(jìn)行反應(yīng)。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)25min的檢測結(jié)果，可以看到檢測反應(yīng)<20min(達(dá)平臺期)。

應(yīng)用實例2： 用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測試。OG變色法為終點變色策略，在反應(yīng)結(jié)束后，倒置反應(yīng)管，溶解管蓋上染料后，陽性樣本呈現(xiàn)出醒目的綠色，陰性表現(xiàn)出橙色，區(qū)分明顯。且該方法不受樣本類型限制，雜質(zhì)耐受性很好。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)20min后檢測結(jié)果。

應(yīng)用實例3：A3825-01 紅黃變色反應(yīng)（肉眼觀察）

以 體外轉(zhuǎn)錄 RNA 為模板，1-6分別為1、10 、100、1000、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板。 上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起

始前，下圖為 65 度反應(yīng) 30min 后。

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