設(shè)計(jì) gRNA

• 確定靶位點(diǎn)：根據(jù)要敲除的基因序列，選擇合適的靶位點(diǎn)。一般選擇基因的編碼區(qū)，尤其是起始密碼子附近或功能結(jié)構(gòu)域所在區(qū)域，以確保敲除后能有效破壞基因功能。

• 設(shè)計(jì) gRNA 序列：針對(duì)選定的靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性的 gRNA 序列。gRNA 通常長度為 20 個(gè)左右的核苷酸，需與靶 DNA 序列精確互補(bǔ)配對(duì)，同時(shí)要避免與基因組中其他非靶區(qū)域有高度同源性，以減少脫靶效應(yīng)。

構(gòu)建表達(dá)載體

• 選擇載體：挑選適合的表達(dá)載體，如常用的質(zhì)粒載體。載體應(yīng)包含能在宿主細(xì)胞中啟動(dòng) gRNA 和 Cas9 蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子，以及篩選標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因，以便后續(xù)篩選陽性克隆。

• 插入 gRNA 和 Cas9 基因：將合成的 gRNA 序列和 Cas9 基因片段通過基因克隆技術(shù)插入到載體中，構(gòu)建成完整的 CRISPR - Cas9 表達(dá)載體。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化

• 轉(zhuǎn)染 / 轉(zhuǎn)化方法選擇：根據(jù)宿主細(xì)胞類型選擇合適的方法將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞，常用的方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔法等；對(duì)于細(xì)菌或酵母細(xì)胞，可采用化學(xué)轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化等方法。

• 轉(zhuǎn)染 / 轉(zhuǎn)化操作：按照所選方法的操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將 CRISPR - Cas9 表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。在導(dǎo)入后，載體進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá) gRNA 和 Cas9 蛋白，gRNA 引導(dǎo) Cas9 蛋白識(shí)別并結(jié)合到靶基因位點(diǎn)。

篩選陽性克隆

• 初步篩選：利用載體上的篩選標(biāo)記基因進(jìn)行初步篩選。例如，使用含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，只有成功導(dǎo)入表達(dá)載體并表達(dá)出抗性蛋白的細(xì)胞才能存活，從而得到初步篩選的陽性細(xì)胞克隆。

• 鑒定陽性克隆：通過 PCR 擴(kuò)增靶基因區(qū)域，然后進(jìn)行測序分析，確定是否在靶位點(diǎn)發(fā)生了基因編輯。只有在靶位點(diǎn)出現(xiàn)堿基缺失、插入或替換等突變，導(dǎo)致基因功能喪失的克隆，才是真正的基因敲除陽性克隆。

  
  

  
  

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單克隆培養(yǎng)與鑒定

• 單克隆分離：采用有限稀釋法或軟瓊脂平板法等，將篩選出的陽性細(xì)胞克隆進(jìn)行單細(xì)胞分離培養(yǎng)，得到單個(gè)細(xì)胞衍生的克隆群體，確保每個(gè)克隆均來自單個(gè)基因敲除細(xì)胞。

• 進(jìn)一步鑒定：對(duì)單克隆細(xì)胞進(jìn)行再次鑒定，除了通過測序驗(yàn)證基因敲除情況外，還可采用 Western blot、免疫熒光等方法檢測基因敲除后蛋白表達(dá)水平的變化，以確認(rèn)基因敲除的效果。

動(dòng)物模型制備（如需要）

• 胚胎注射：如果要制備基因敲除動(dòng)物模型，如小鼠，可將 CRISPR - Cas9 系統(tǒng)注射到受精卵中。通過顯微操作技術(shù)，將含有 gRNA 和 Cas9 蛋白或 mRNA 的溶液注射到受精卵的原核或細(xì)胞質(zhì)中，然后將注射后的受精卵移植到代孕母鼠的輸卵管中，讓其發(fā)育成胚胎。

• 基因敲除動(dòng)物鑒定：待幼鼠出生后，通過提取鼠尾基因組 DNA，采用 PCR 和測序等方法鑒定基因敲除情況，篩選出基因敲除陽性的動(dòng)物個(gè)體，即得到基因敲除株動(dòng)物模型。

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